环磷酸腺苷的研究进展

樊君，石奇，尚红伟，李 海 瑞 ，李振东，高续春(西北大学化工学院，陕西 西安710069)

中图分类号：R977.4             文献标识码：A             文章编号：1007-7693(2005)07-0597-03

环磷酸腺苷(cyclic  Adenosine-3',5'-monophosphate,简  称cAMP)是核苷酸的衍生物，为蛋白激酶致活剂，是有机体  中广泛存在的一种具有生理活性的重要物质，由ATP在腺苷  活化酶催化下生成，是细胞内传递激素和递质作用的中介因  子，因此被称为“第二信使”。其灭活酶为磷酸二脂酶。它对  很多酶催化的反应具有调节作用，可调节与细胞内贮藏的糖  和脂肪反应的一系列酶的活性，对蛋白质的生物合成也具有  调节控制作用。可广泛参与细胞功能的调节，能舒张平滑  肌、扩张血管、改善肝功能、促进神经再生、抑制皮肤外层细  胞分裂和转化异常细胞的功能、促进呼吸链氧化酶的活性、 改善心肌缺氧等。国外对其生理活性、作用机理进行了大量  研究，涉及疾病治疗、信号表达、基因复制等方面。环磷酸腺  苷(cAMP)可以通过化学合成、生物发酵、天然产物分离提取 等方法获得。

1  生理活性

cAMP的胞内浓度增高有利于改善心脏内心肌、骨骼肌、 横纹肌的疲劳程度。临床实践证明病人由于骨骼肌疲劳造  成的心脏病得到了缓解1。Mulieri Louis 等人研究了 cAMP    对右冠状动脉疾病、二尖瓣回流(mitral regurgitation)、扩张性  心疾病、原发性心肌病作用的机理，认为cAMP 浓度的变化  改变了钙泵的控制2;对免疫系统的影响方面，研究者发现  在兔子的腹膜巨噬细胞中，cAMP 浓度的增高会明显抑制过  氧化物的产生，提示环磷酸腺苷可以在医疗上用作过氧化物  过度产生的保护剂³]。Bevilaqua L 等人研究了cAMP对脑的  作用，在小鼠的后海马区两侧注人1.25μg 的 cAMP 及其他  辅助兴奋剂，使细胞内cAMP浓度升高，经过不同时间的训  练后，测试结果显示其记忆程度衰退。证实海马细胞中  cAMP的浓度影响着记忆固化4。另有研究者对20个月的  小鼠进行行为测试，将其分为workers、parasite、inventors、lazy    四组，分析了四组小鼠的左右半脑细胞中cAMP的含量。结  果发现四组之间存在着明显差异，说明脑细胞中cAMP的含  量和动物的行为方式相关5。研究证明cAMP可以刺激神经  产生胆碱能作用，从而影响快眼动期睡眠(rapid eye move-   ment   sleep)。cAMP 含量增高，则显著降低快眼动期睡  眠6。同时cAMP对髓鞘的形成、破碎、修复及髓鞘基因的  调节、表达、信号传递均有影响7。当小鼠被注射 cAMP    (5nmol/min× 100g 体重)时，发现磷、钠的排泄量显著增高， 当剂量增大时，血浆中cAMP的浓度也增高，说明了cAMP对  肝、肾的影响[8。在肾上皮细胞中，cAMP抑制了一氧化氮的  合成，可以减少细胞受伤，起保护作用9)。cAMP可以活化磷  酸化酶蛋白激酶A,从而对转录因子起作用10]。有研究表明  中国现代应用药学杂志2005年8月第22卷第7期

cAMP调节人类肾素基因的转录[!1。嗜铬细胞中，cAMP 浓 度的增长引起酪氨酸羟化酶基因表达的增长，增长是通过 mRNA转录过程实现的[123。脑白质肾上腺萎缩症(adrendeu-  kodystrophy)是一种遗传的脂肪酸代谢紊乱疾病。增高 cAMP的浓度则可激发过氧化物酶体的活性，反之则抑制，因 此可用于该病的治疗〔13〕。cAMP 还可促进口腔角质细胞的 增殖[14],抑制小鼠的主动脉平滑肌细胞中分裂素活化蛋白 激酶的活性[15],还可抑制支气管哮喘的炎症。临床还用于 牛皮癣的治疗{16。

2   制备方法

2.1 化学合成

Smith 等人在1961年合成了cAMP,此法主要是用5'-核 苷酸和4-吗啡啉-N,N-二环己基眯在吡啶中用DCC(Dicyclo-  hexyl-Carbodiimide) 作脱水剂进行脱水反应，而使5'-腺苷酸 发生内酯化，为避免分子间的反应，反应必须在高度稀释条 件下进行，因而要用大量无水毗啶，吡啶对人体危害很大，并 对环境有污染[17]。又有人采用了二甲基甲酰胺(dimethyl  formamide)、二甲基亚砜( Dimethyl sulfoxide)为溶剂，这两种 物质对反应物的溶解性与毗啶相似，但由于其沸点较高，在 反应后处理阶段进行浓缩时，不易除尽，使产物难于提 纯[18]。1986年，我国的研究者又探索了新的溶剂系统。2. 5g 的5'-AMP 和 2 g 的4-吗啡啉-N,N- 二环己基眯溶解于 40mL的乙二醇单甲醚中与含4g DCC的450mL乙二醇单甲 醚溶液在120℃滴加反应，回流1h, 降温，加金属钠调pH 至 碱性，继续回流3h。蒸干溶剂，将产物溶于水后过滤，再用 50mL乙醚萃取三次水层减压浓缩，用浓盐酸调 pH 至1～2, 然后放置过夜析晶，用乙醇、乙醚洗涤并干燥，粗品的收率为 59%[193。

2.2 生物发酵

日本研究者采用基因重组的手段获得了菌种Escherichi- a coli K-11,可发酵生产cAMP。摇床28℃培养14h, 培养基 为：葡萄糖0.5%,KH₂PO₄0.6%, K₂HPO₄1.4%,(NH₄)₂SO₄

0.2%,MgSO₄·7H₂O0.02%,  蛋白胨0.4%,酵母粉0.02%, 培养液中cAMP的浓度为3.9mg/150mL[20。

2.3  从天然产物中提取

cAMP的多种生理活性引起了人们的关注，寻找富含 cAMP的动、植物组织成为热点。动物的脑、肾等多种细胞中  均含有，但含量均很小。所以，人们把目光投向了植物，测定  了多种植物中cAMP的含量[20~223.

上表中大枣的 cAMP 含量为44个枣品种的平均值，其

中山西木枣含量高达302.50nmolg.fw 。酸枣的数值是测得 Chin JMAP,2005 August,Vol.22 No.7                ·597·

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表 1  植物中cAMP的含量

Tab 1 The cAMP content of plant

59个品种后的平均值，最高值为152.00nmol。除了直接测定 植物中的含量，人们还试图通过植物组织培养来提高 cAMP  的含量，以期使从植物中提取 cAMP成为可行。Ashton 等人 悬浮培养了黑麦草(rye grass)胚乳组织，发现内源 cAMP的 浓度在3-14pmol/g 鲜重之间变化23]。Johnson 等人通过烟 草组织培养，获得了90-130pmol cAMP/g鲜重{24]。Brown 和 newton将四季豆秧苗培养6d后，用结合蛋白测定法测得其 内源性cAMP 含量为2.2nmolg 干重[25]。但是Van Onckelen 等人质疑了该结果。他们将四季豆(Phaseolus vulgaris L.)的 种子在21℃,80%的湿度条件下播种，秧苗生长时，12h白炽 灯照射，12h处于黑暗，反复交替。培养6d后，将秧苗浸泡在 乙醇和水中，于液氮中冷冻，然后将其冻干。同时还对照培 养了低等植物绿藻(Chlorella sp.)。 采用的培养基为：KNO₃  10mmol/L,KH₂PO₄0.21mol/L,MgSO₄·2H₂070mmol/L,Zn- SO₄0.14mmol/L,CuSO₄·5H₂03.16μmol/L,MnSO₄·H₂

010μmol/L,Ca(NO₃)₂·6H₂02.34mmol/L,(NH₄)₆Mo₇O₂24

·4H₂00.14μmol/L,CaCl₂40μmol/L,柠檬酸铁20μmol/L,柠 檬酸30μmol/L。培养两周后，得到培养物，离心，将沉淀冻  干。然后将这两种混合物经过多步前处理后，用木炭吸附， 采用聚乙烯毗咯烷酮(PVP)和Dowex柱层析，再通过制备级  高效液相色谱(HPLC)纯化，得到cAMP。通过分析级高效液  相色谱和结合蛋白两种方法测定，确定了四季豆秧苗中的  cAMP 含量为13.6～19.7pmol/干重；绿藻中cAMP含量为69  ~92pmol/g干重[26]。Hanabusa 提取了大枣中的 cAMP,将枣  粉于5℃搅拌1h, 离心收集沉淀并溶于水，上两次Dowex 1x4   型甲酸柱，用0.05N甲酸做洗脱液，再上氧化铝柱，所得组份  冷冻干燥，最后得到纯度为34%的cAMP,TLC纯化后纯度提  高到97%[27】。作者将陕北佳县油枣粉碎后，室温浸提三次， 离心，上清液真空浓缩，上强碱性阴离子柱，用甲酸洗脱，洗  脱液经浓缩处理后得到cAMP。

3  分析方法

3.1    高效液相色谱法

·598·                       Chin JMAP,2005 August,Vol.22 No.7

高效液相色谱法具有方便、迅速、所需样品量少的优点。 将含有cAMP的植物干燥制成粉末，水浴提取后，取其上清  液作为样品溶液。采用Asahipak ODP-50(C₁8,150mm×4.6   mm,Asahikasei) 色谱柱，流动相为50mmol/L KH₂PO₄-CH₃   OH(95:5) ,流速为0.8mL/min,检测器SPD-6A(Shimadzu,日  本岛津)在波长254nm 处于室温下检测，16min 开始出 峰[28]。

3.2    竞争蛋白法

将待测样或标准样与H-cAMP、结合蛋白混合均匀，置于 冰浴中2～3h,加入冰冷的洗涤缓冲液(20mmol/L pH7.5的 磷酸盐溶液),终止反应，将反应液滴加在处理好的微孔滤膜 上抽滤，80℃烘干滤膜，将其放在盛有闪烁液(PPO 和POPOP 的二甲苯溶液)的计数瓶中，进行液闪计数[29]。

3.3    薄层层析

植物提取cAMP的含量在30%以上时，可以用薄层层析 进行检测及纯化。以硅胶为固定相，苯-乙酸乙酯-甲醇(1:1: 3),作为展开剂，紫外灯下检识(R,0.75), 出现黑色斑点。用 此方法纯化可将cAMP 含量提高至90%以上[27]。

3.4    其它分析方法

酶联免疫法是利用生物获得半抗原，进行荧光检测的方 法，该法具有灵敏度高、需样品量少的特点[30]。Stephen 等人 建立了荧光比率成像( Fluorescence ratio imaging)方法。将 cAMP标记上荧光物质，根据其荧光变化的强弱测量其浓度 变化，可以不破碎细胞，有利于了解胞内生理活动3]。毛细 管电泳和紫外联用可以把cAMP 和cGMP、cIMP分开，22KV  下操作上柱展开30min,在210nm 波长处检测出峰，但该方 法设备昂贵[32】。

4  展望

cAMP 具有广泛的生理活性，它是当前分子生物学研究  的重要内容之一，据医学临床证明，它与牛皮癣、冠心病、气  喘、高血压、糖尿病以及恶性肿瘤关系十分密切，在蛋白质的  合成中，基因的转录和翻译都受cAMP的影响。它控制遗传  信息，起着“第二信使”的作用，并影响许多酶的活性和细胞  的代谢过程。研究工作和医学临床试验均需大量的 cAMP。 但化学合成所用溶剂有一定毒性，易污染环境，生物发酵受  菌种限制且难以分离，而植物尤其是大枣中cAMP 含量是目  前所知中最高的，如何从天然产物中分离出纯度高的cAMP,    是当前研究的所要解决的问题。

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收稿日期：2005-04-30

生物抗氧化剂生产及发展

胡 忠 策 ，郑 裕 国*(浙江工业大学生物工程研究所，浙江杭州310014)

中图分类号：R977. 2              文献标识码：A             文章编号：1007-7693(2005)07-0599-04

摘要：目的  对主要几种重要的生物抗氧化剂的生产、研究和应用的进展进行综述。方法 查阅近年来有关生物抗氧化剂研  究的国内外文献，结合作者近几年有关生物抗氧化剂的研究开发。结果与结论 生物抗氧化剂不仅具有抗氧化性能，还有生  理活性功能，成为国内外研究的热点；虾青素是一种类胡萝卜素，具有优良抗氧化性能，有很好的开发前景。

关键词：生物抗氧化剂；类胡萝卜素；虾青素

Bio-antioxidant   production   and   its   progress

HU    Zhong-ce,ZHENG    Yu-guo(Institute of Bioengineering,Zhejiang University of Technology,Hangzhou,China,310014)

ABSTRACT:OBJECTIVE The developments of bio-antioxidants production,research and application were reviewed.METHOD Literatures about bio-antioxidants in recent years were referred,and our research results about bio-antioxidants were summarized.

RESULTS AND CONCLUSION Bio-antioxidants have strong antioxidant activity with some physiological functions.Moreover, astaxanthin,a kind of carotenoid,was recommended.

KEY     WORDS:bio-antioxidants;    carotenoid;astaxanthin

1  概述

生物抗氧化剂有时也称为天然抗氧化剂，主要是指在生 物体内合成的具有抗氧化作用或诱导抗氧化剂产生的一类 物质，是一类能够清除氧自由基，抑制或消除以及减缓氧化

反应的物质。

在生物体中各类抗氧化剂主要由以下作用机制单个或 联合发生作用而起到抗氧化作用：减少氧化底物中的局部氧 浓度；消除启动脂质过氧化的引发剂；结合金属离子，使其不

‘ 通讯作者，男，博士，教授，博士生导师，主要从事生物催化与转化的研究，E-mail:zhengyg@zjut.  edu.cn

中国现代应用药学杂志2005年8月第22卷第7期                             Chin JMAP,2005 August,Vol.22 No.7               ·599·

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红枣提取液的环磷酸腺苷每百毫升≥25毫克